Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất sinh khối tế bào và rễ sâm Ngọc Linh in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là cây dược liệu quý bản địa, có giá trị y dược rất cao, đã được Nhà nước xác định là sản phẩm quốc gia, có giá trị không thua kém nhân sâm Triều Tiên. Hợp chất thứ cấp ở sâm Ngọc Linh với nhiều tác dụng dược lý quan trọng đã được chứng minh trong y học cổ truyền và hiện đại. Trồng trọt tự nhiên đối với sâm Ngọc Linh thường bị chi phối bởi các điều kiện môi trường đặc thù như nhiệt độ, thời tiết, độ che phủ, đất, sâu bệnh. Rễ cây sâm Ngọc Linh chỉ có thể được thu hoạch với chất lượng cao ở giai đoạn 5 - 7 năm sau trồng.
Trên thế giới, ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào bao gồm vi nhân giống quy mô lớn và sản xuất sinh khối in vitro trong các bioreactor được coi là giải pháp đột phá trong phát triển và sản xuất nguyên liệu dược theo hướng hiện đại, là chìa khoá để đưa lĩnh vực sản xuất thương mại đạt tới trình độ cao và phát triển bền vững. Nuôi cấy mô tế bào đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi và hiệu quả trên thế giới để sản xuất sinh khối và các hoạt chất, nhất là các saponin ở cây nhân sâm. Gần đây, sinh khối tế bào và rễ bất định nhân sâm đã được sản xuất quy mô lớn, thương mại bằng các bioreactors. Các điều kiện môi trường và thiết bị công nghệ nuôi cấy in vitro có ảnh hưởng tới sản xuất sinh khối và dược chất đã được rất nhiều tác giả ở nhiều quốc gia khác nhau nghiên cứu.
Để xây dựng được các quy trình công nghệ nuôi cấy mô tế bào, rễ in vitro và chiết xuất được hoạt chất từ cây dược liệu Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) dùng làm nguyên liệu dược phẩm hoặc mỹ phẩm, nhóm Viện sinh học Nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam do TS. Nguyễn Hữu Hổ làm chủ nhiệm đã đề xuất và được giao thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất sinh khối tế bào và rễ sâm Ngọc Linh in vitro” nhằm tạo tiền đề cho nghiên cứu triển khai sản xuất quy mô lớn trong tương lai.
Sau một thời gian triển khai thực hiện, đề tài đã thu được một số các kết quả như sau:
1) Đối với nghiên cứu tạo và nuôi cấy tế bào
- Mô sẹo xốp cho khả năng khởi tạo và tăng trưởng huyền phù cao hơn so với mô sẹo cứng. Khối lượng mô sẹo cấy ban đầu thích hợp dùng tạo huyền phù là 4% (w/v).
- Đã xây dựng được quy trình nuôi lỏng lắc tế bào trong bình tam giác (250 ml - 1000 ml) dùng môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l NAA, 50 g/l đường, tốc độ lắc 120 vòng/phút.
- Đã xây dựng được quy trình nuôi cấy tế bào bằng hệ thống bioreactor ‘BioFlor’ (có cánh khuấy) dùng môi trường MS có 20% nước dừa, 50 g/l đường, khối lượng mô tế bào cấy ban đầu 0,5% (w/v) với kết quả tỷ lệ tăng trưởng sinh khối là 2,14 lần sau 15 ngày nuôi.
- Đã xây dựng được quy trình nuôi cấy tế bào bằng hệ thống bioreactor sục khí (3 lít, 5 lít) dùng môi trường MS có 20% nước dừa, 50 g/l đường, khối lượng mô sẹo cấy ban đầu 1% (w/v) với kết quả tỷ lệ tăng trưởng sinh khối đạt 2,1 - 2,3 lần sau 4 tuần nuôi cấy.
- Vào ngày nuôi cấy thứ 15, bổ sung 2 g/l casein hydrolysate vào môi trường SH có 20% nước dừa; bổ sung sorbitol 70 g/l vào môi trường MS có 20% nước dừa; bổ sung 100 µmol/l Methyl jasmonate vào môi trường SH có 20% nước dừa làm tăng lần lượt 1,9 lần, 2,3 lần và 2,35 lần hàm lượng saponin tổng số so với đối chứng sau 30 ngày nuôi.
2) Đối với nghiên cứu tạo và nuối cấy rễ bất định
- Với vật liệu nuôi cấy là chồi đơn và cụm chồi, môi trường MS½ có 3 mg/l NAA, nồng độ đường 50 g/l thích hợp cho tạo rễ. Với vật liệu là mô sẹo, môi trường SH có bổ sung 5 mg/l IBA, 50 g/l đường thích hợp cho tạo rễ bất định từ mô sẹo cứng.
- Đã xây dựng được quy trình nuôi rễ bất định trên môi trường đặc (môi trường SH có 5 mg/l IBA).
- Đã xây dựng được quy trình nuôi lỏng lắc (100 - 140 vòng/phút) rễ bất định trong bình tam giác (250 ml - 1.000 ml) với môi trường nuôi thích hợp là SH có 5 mg/l IBA, khối lượng rễ bất định cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), kết quả tỷ lệ tăng trưởng sinh khối từ 4,4 – 4,8 lần (tùy thể tích).
- Đã xây dựng được quy trình nuôi rễ bất định bằng hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời với môi trường nuôi SH có 5 mg/l IBA, khối lượng rễ cấy ban đầu là 2% (w/v), tần suất phun 2 phút/lần (thời gian phun 1 phút).
- Đã xây dựng được quy trình nuôi nhân rễ bất định bằng hệ thống bioreactor sục khí (3 lít, 5 lít) với môi trường nuôi thích hợp là SH có 5 mg/l IBA, khối lượng rễ tơ nuôi cấy ban đầu thích hợp cho sự gia tăng sinh khối là 2% (w/v), tỷ lệ tăng trưởng sinh khối 5 lần sau 45 ngày nuôi.
- Xử lý elicitor Methyl jasmonate nồng độ 10 mg/l (so với 2 mg/l và 5 mg/l) và thời gian xử lý Methyl jasmonate là 10 ngày trước thu hoạch rễ (so với 5 ngày) được xem là thích hợp đối với kích thích tăng hàm lượng saponin tổng số ở rễ bất định (tăng 1,2 lần so với đối chứng).
3) Đối với nghiên cứu tạo và nuôi cấy rễ tơ
- Đã tạo được 06 dòng rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 và 3 dòng rễ tơ do Agrobacterium rhizogenes TR7 từ đoạn cuống lá và lát mỏng tế bào cuống lá của chồi tăng trưởng in vitro (đã qua kiểm tra PCR gen rol).
- Đã xây dựng được quy trình nuôi rễ tơ trên môi trường đặc (môi trường SH có 50 g/l đường saccharose).
- Đã xây dựng được quy trình nuôi lỏng lắc (100 - 140 vòng/phút) rễ tơ trong bình tam giác 250 ml - 1.000 ml với môi trường nuôi thích hợp là SH, khối lượng rễ tơ cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), tỷ lệ tăng trưởng sinh khối từ 5,2 - 5,4 lần.
- Đã xây dựng được quy trình nuôi rễ tơ trong hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời với môi trường nuôi thích hợp là SH, tần suất ngập chìm thích hợp cho sự gia tăng sinh khối rễ tơ là 2 giờ/ lần, thời gian ngập chìm là 1 phút/lần 411 bơm, khối lượng rễ tơ nuôi cấy ban đầu thích hợp cho sự gia tăng sinh khối là 2% (w/v).
- Đã xây dựng được quy trình nuôi nhân rễ tơ bằng hệ thống bioreactor sục khí (3 lít, 5 lít) với môi trường nuôi thích hợp là SH, khối lượng rễ tơ nuôi cấy ban đầu thích hợp cho sự gia tăng sinh khối là 2% - 3% (w/v).
- Xử lý elicitor Methyl jasmonate nồng độ 10 mg/l (so với 5 mg/l) và thời gian xử lý Methyl jasmonate là 10 ngày trước thu hoạch rễ (so với 15 ngày) được xem là thích hợp đối với kích thích tăng hàm lượng saponin tổng số ở rễ tơ (tăng 1,26 lần so với đối chứng).
4) Chiết xuất hoạt chất thứ cấp saponin
Đã xây dựng được quy trình chiết xuất saponin toàn phần từ tế bào, rễ bất định và rễ tơ dựa trên kỹ thuật đã được phổ biến bao gồm các khâu chính như chiết saponin toàn phần, định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng, định lượng saponin tổng/đơn bằng phương pháp so màu/HPLC.
Trên cơ sở các quy trình nuôi cấy đã xây dựng được ở đề tài, cần triển khai nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi lỏng quy công nghiệp dùng các thiết bị nuôi có thể tích từ hàng trăm đến hàng nghìn lít để thu sinh khối sạch dư lượng chất điểu hòa tăng trưởng/khoáng, sản phẩm hoạt chất thứ cấp phục vụ cho ngành mỹ phẩm, dược phẩm kể cả lĩnh vực thực phẩm chức năng, bao gồm quy trình nuôi cụm tế bào có khả năng sinh phôi/cụm phôi/cụm chồi nhằm thu sinh khối có thể dùng trực tiếp hoặc qua chế biến, quy trình nuôi rễ tơ và rễ bất định nhằm thu sản phẩm thứ cấp saponin.
Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 18094/2020) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.
https://vista.gov.vn/
