Nghiên cứu chế tạo bộ KIT phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella trong sản phẩm thịt gia súc, gia cầm
Vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân hàng đầu gây ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm trên thế giới và là mối đe doạ đến sức khoẻ cộng đồng ở hầu hết các nước thông qua việc tiêu dùng các thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt lợn, thịt gà (White et al., 2001; Kuhn et al., 2010). Theo tác giả Yang và cs (2010) cho biết tại Trung Quốc 54% thịt gà và 17% thịt lợn ô nhiễm vi khuẩn Salmonella. Tại Đan Mạch, thịt lợn cũng là nguồn lây nhiễm chính của vi khuẩn Salmonella (Kuhn et al., 2010).
Những năm gần đây tại nước ta, thực phẩm có nguồn gốc động vật (chủ yếu là thịt lợn và thịt gà) không những phục vụ tiêu dùng trong nước mà còn đang tiếp tục được mở rộng để xuất khẩu đến một số thị trường có yêu cầu cao về các chỉ tiêu vi sinh vật, luôn đòi hỏi những sản phẩm chất lượng tốt. Tất cả các tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm trong nước cũng như Quốc tế đều không cho phép có Salmonellaspp trong sản phẩm. Sự hiện diện của loài vi khuẩn này luôn được kiểm soát chặt chẽ. Tuy nhiên, thực tế tại nước ta, vi khuẩn Salmonellaspp ô nhiễm trong thịt và sản phẩm thịt gia súc, gia cầm được phát hiện với tỷ lệ cao tại hầu hết các vùng miền và ở điều kiện bảo quản khác nhau. Theo tác giả Trần Thị Xuân Mai và cs (2011), tỷ lệ ô nhiễm vi khuẩn Salmonella spp ở sản phẩm nem chua (20%), thịt lợn (47,5%), thịt bò (30%), và thịt gà (46,7%). Để đảm bảo tiêu chuẩn vi sinh của sản phẩm thịt động vật cho tiêu dùng trong nước và xuất khẩu, yêu cầu về phương pháp kiểm soát chất lượng vi sinh vật cần được cải tiến để việc phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm được thực hiện và thu được kết quả một cách nhanh và chính xác nhất. Một số phương pháp phát hiện Salmonellaspp đang được áp dụng hiện nay như phương pháp nuôi cấy thông thường theo tiêu chuẩn quốc gia (TCVN 1078-1:2017) hay phương pháp định lượng Salmonella MPN theo TCVN 1078-2:2015. Mặc dù là tiêu chuẩn vàng, nhưng phương pháp truyền thống để phát hiện Salmonella trong thực phẩm thường tốn nhiều thời gian (5-7 ngày) với chi phí tốn kém.
Với những tiến bộ trong công nghệ sinh học phân tử đã và đang được áp dụng để kiểm tra phát hiện nhanh sự hiện diện của vi khuẩn thông qua việc khuếch đại nhanh chóng các trình tự nucleotide mục tiêu hiện là phương pháp phổ biến trong phòng thí nghiệm. Phương pháp sinh học phân tử để khuếch đại ADN bằng kỹ thuật PCR đơn mồi, đa mồi, hoặc Realtime-PCR đã được các nhà khoa học trên thế giới (Gentry-Weeks et al., 2002; Kumar, 2006; Salehi et al., 2007) cũng như các nhà khoa học trong nước áp dụng rộng rãi. 4 Tuy nhiên, các phương pháp này yêu cầu trang thiết bị đắt tiền nên chi phí cho việc xét nghiệm mẫu rất tốn kém.
Xuất phát từ thực tiễn trên, Cơ quan chủ trì Viện Thú y cùng phối hợp với Chủ nhiệm đề tài TS. Đặng Thị Thanh Sơn thực hiện “Nghiên cứu chế tạo bộ KIT phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella trong sản phẩm thịt gia súc, gia cầm” với mục tiêu chế tạo được bộ KIT phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella trong sản phẩm thịt gia súc, gia cầm phục vụ giám sát an toàn thực phẩm cho tiêu dùng trong và xuất khẩu.
Kỹ thuật RPA là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ở nhiệt độ 37-40oC (là công nghệ sử dụng quy luật khuếch đại gen trong cơ thể sống), có thể cho kết quả nhanh trong vòng 30 phút với độ chính xác 100% mà không cần đến các thiết bị biến nhiệt đắt tiền. Công nghệ này có những ưu điểm vượt trội so với các kỹ thuật khác do chỉ sử dụng một cặp primer có kích thước dài 29-30 nucleotide và được enzyme kết hợp để rà soát sự tương đồng với trình tự đích giúp khắc phục được vấn đề nhiễm chéo ở 37oC. Thay cho việc sử dụng nhiệt để tách ADN sợi kép, RPA đã sử dụng các enzyme để tách sợi đôi ADN. Phức hệ Recombinase-Primer quét kiểm tra (Scan) ADN sợi kép và dễ dàng chuyển đổi sợi tại vị trí tương đồng (Euler et al., 2012). Sự khuếch đại đoạn gen theo cấp số nhân xảy ra trong vòng 20 phút ở nhiệt độ 37-42oC. Sản phẩm khuếch đại theo kỹ thuật này cũng có thể kiểm tra bằng phương pháp điện di thông thường hoặc bằng que thử nhanh trong vòng 5-10 phút theo nguyên lý miễn dịch. Kỹ thuật khuếch đại gen RPA kết hợp với việc sử dụng que thử nhanh đã làm tăng tính đơn giản của việc tạo KIT xác định nhanh tác nhân gây bệnh, trong trường hợp này là vi khuẩn Salmonella spp.
Để áp dụng kỹ thuật RPA cần xác định các gen đặc trưng của vi khuẩn này, nghĩa là các gen có trong các chủng vi khuẩn Salmonella mà không có trong các chủng vi khuẩn khác. Nghiên cứu để hạn chế tối đa các kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả là những nội dung rất quan trọng và sẽ được thực hiện trong khuôn khổ đề tài này để lựa chọn được một gen hoặc một tổ hợp các gen đích có tính đặc trưng cho các serotype Salmonella thường gặp trong các mẫu thực phẩm ở Việt Nam. Việc xác định các đoạn gen đặc trưng cho mỗi serovar nêu trên làm gen đích để khuếch đại gen bằng kỹ thuật real-time PCR, LAMP, và kỹ thuật RPA sẽ được nhóm nghiên cứu thực hiện để làm cơ sở sản xuất KIT phù hợp để phát hiện các kiểu huyết thanh Salmonella ở nước ta.
Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã thu được những kết quả như sau:
- Nghiên cứu thiết kế và tối ưu hoá thành công 9 cặp mồi/probe được sử dụng trong các kỹ thuật PCR, RT-PCR, LAMP và RPA để phát hiện Salmonella spp trong sản phẩm thịt gia súc, gia cầm.
- Đã chế tạo thành công 500 KIT RPA (Recombinase Polymerase Amplication) que thử nhanh.
- Sản phẩm chính của đề tài dùng để phát hiện Salmonella trong thực phẩm. KIT RPA với các ưu điểm nổi bật về độ nhạy của KIT đạt 97,3% và độ đặc hiệu đạt 96,4%. Ngưỡng phát hiện của KIT là 5-6 bản copy genome (102 cfu/ml) vượt chỉ tiêu đăng ký theo thuyết minh. Thời gian cho kết quả chỉ từ 20-30 phút sau khi tăng sinh mẫu. Bộ KIT dễ sử dụng, không cần đến các thiết bị luân nhiệt đắt tiền. Mẫu dương tính được phát hiện trực tiếp bằng mắt thường quan sát vạch trên que thử nhanh. Cặp mồi/probe đặc hiệu và dung dịch Lysis Buffer để tách chiết ADN mẫu được nội địa hóa, điều này mang lại lợi ích giảm giá thành của sản phẩm.
- Bản quy trình chế tạo, sử dụng và bảo quản KIT RPA đã được hoàn thành và được nghiệm thu tại Hội đồng cơ sở đạt kết quả xuất sắc.
Có thể tìm đọc báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 18607/2021) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.
https://vista.gov.vn/
